WB实验中如何转膜？

2024-11-26 一、WB原理WB（WesternBlot，蛋白质印迹法）实验的基本原理在于抗原与抗体之间的特异性结合特征，从而实现对特定蛋白质的检测。作为分子生物学领域中最为常用的实验之一，WB涉及诸多技巧与知识，然而想要获得令人满意的WB检测结果并非易事。二、WB实验步骤三、电泳后如何转膜？1.准备转膜装置：依次放入海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜或NC膜、滤纸、海绵，注意各层之间不能有气泡。2.转膜：恒流200-300mA转膜1-2小时（根据蛋白分子量和膜的类型调整）。注：转膜的方法WB实验...

怎么解决细胞被污染的问题？

2024-11-26 从事细胞培养工作时都有可能面临细胞受到污染的境况。对于细胞的受污染问题，最为紧要的在于防范，因为一旦细胞受到污染，欲挽回已十分艰难，即便成功挽回，细胞的状态亦会受损，进而对实验结果造成影响。怎么解决细胞被污染的问题？把细胞污染分为早期污染和晚期污染两种情况。早期污染是细胞状态变差，但依旧能保持生长，显微镜下未见明显微生物或可见少量微生物。这种情况的话我们在换液时可以多用PBS洗几次，然后加入适合的抗生素。早期污染只要发现及时，处理得当，救回来的可能性还是很大的。晚期污染则是细...

PCR buffer基本组分

2024-11-25 一、buffer是干什么的？PCRbuffer（缓冲液）的作用就是给Taq酶提供一个最适的反应条件。一般含有Tris－HCL，Mgcl2+等成分。不同的pcrbuffer成分可能不一样。二、buffer基本组分1、Tris-HCl：具有良好的缓冲能力和对多种酶的兼容性，在PCR中的主要作用是调节反应体系的pH值，使PCR反应过程维持在一个稳定的ph范围内；为酶反应提供恒定的酸碱环境，保持酶的活性，确保PCR扩增的顺利进行。2、K+：主要发挥稳定酶活性和参与模板DNA的解链作用...

如何降低非特异性扩增？

2024-11-25 一、扩增方式扩增方式一般有两种，对称扩增和不对称扩增。1、对称扩增使用等量的引物进行PCR扩增，扩增产物量随着PCR循环呈指数增长，一般的PCR，使用的都是这种方式。由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR扩增的过程中会水解探针，导致探针被耗尽，无法用于熔曲分析；若使用抗酶切修饰的探针，可一定程度降低水解，但由于探针阻碍了聚合酶通过，扩增效率会大幅下降。对称扩增产生的互补双链，会与探针竞争结合靶序列，不利于探针结合到靶序列上，熔曲分析可能会出现异常。优点：灵敏...

病毒滴度的单位有哪些？

2024-11-22 一、病毒滴度病毒的滴度：单位体积(通常为mL)液体中具有生物活性的病毒颗粒数。滴度是一个病毒自身复制的数量概念，可分为物理滴度和感染滴度。物理滴度是指包含病毒基因组的病毒颗粒的浓度，可以通过通过定量PCR对病毒颗粒的基因组拷贝数进行检测，也可以通过测定病毒颗粒中的特定蛋白进行定量，但物理滴度未考虑到病毒活性和感染效率，因此是不准确的。感染滴度是指成功转导细胞的病毒颗粒的浓度，须通过细胞感染实验来测定，如利用定量PCR对细胞中的病毒基因拷贝数进行检测，或通过携带荧光的病毒感染细...

IHC染色不均匀分析

2024-11-22 上次我们分享了IHC未染色或无信号的原因分析，这次让我们来看看IHC染色不均匀是为什么吧。一、组织切片制备解释：组织切片薄厚不均匀→建议：更换刀片二、组织固定1.解释：酒精固定不足会产生伪影；→建议：延长固定时间；尝试不同的固定液2.解释：固定延迟导致抗原扩散；建议：立即固定组织；可以考虑使用交联固定剂三、脱蜡解释：脱蜡不wan全→建议：使用新鲜的二甲苯四、抗体兼容性解释：一抗可能结合其他抗原上的表位→建议：从多抗切换至单抗；尝试不同的单抗五、透化解释：细胞膜被破坏，膜蛋白丢...

IHC未染色或无信号原因分析

2024-11-21 IHC未染色或无信号的原因：一、‌抗体问题‌：抗体与一抗或二抗不兼容、抗体浓度不合适、抗体失效或储存不当等都会导致无染色。例如，使用抗一抗种属来源的二抗，确认二抗是否识别一抗的亚型；使用更高浓度的抗体或延长孵育时间；设置阳性对照，确保抗体仍然有效‌。二、‌抗原修复不足‌：固定步骤可能会改变抗体识别的抗原表位，导致抗原修复不足。使用微波或压力锅进行抗原修复，确保使用新鲜配置的修复液‌。三、‌样本处理不当‌：样本存放时间过长、切片制备不当（如脱蜡不ce底）、组织切片干片等都会影响...

蛋白芯片是什么？

2024-11-21 一、蛋白芯片简介‌蛋白芯片‌是一种高通量的蛋白质功能分析检测技术，主要用于监测蛋白质之间的相互作用。其基本原理是将各种蛋白质有序地固定于载体上，然后利用标记了特定荧光物质的抗体与芯片上的蛋白质结合，通过荧光强度分析蛋白质的表达数量和相互作用关系‌。二、蛋白芯片的工作原理蛋白芯片通过将已知的蛋白质分子固定在固相载体上，然后捕获与之特异性结合的待测蛋白质。这些待测蛋白质可能存在于血清、血浆、尿液等生物样本中。通过洗涤和纯化步骤后，利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术测定各点的荧光强度...